1实验方法
囊腔组织经液氮速冻后，放入-70℃冰箱保存备用。Real-time PCR法检测EMMPRIN的mRNA含量。
1.1组织总RNA提取：
（1）从液氮中取出组织，用已处理过的剪刀剪取约100mg组织块，加入1ml Trizol试剂，转移至匀浆器中，将匀浆器置于冰水上充分研磨，转移研磨好的匀浆液至无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，室温下静置5min。
（2）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀10次充分混匀，室温下静置2-5min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间10min；
（3）小心吸取上层水相溶液至另一无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，小心吸取上层水相，勿碰及或吸走中间层，否则要重新离心再吸取（可吸取约0.4-0.5 ml）。
（4）加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温下静止15min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间15min。小心弃上清，沿管壁加入1ml 75%乙醇（DEPC水配置,预冷），室温下静置1min，4℃状态下离心，速度7500r/min，离心时间5min；小心倒掉上清，再4℃状态下离心，速度3500r/min，时间离心1min；离心后用10μl枪头小心吸去残余液体，最后用30μlDEPC-H2O溶解RNA。
（5）提取的总RNA经紫外分光光度计测定，提取物浓度OD 260/280比值在1.8-2.0之间。
1.2逆转录反应：
用上述细胞中提取的2μg总RNA在下述20μl反应体系中逆转录成cDNA,该反应体系组成如下：5×RT-Buffer 4μl, oligd(T) 2.5μmol/L, dNTPs 5mmol/L, RNA酶抑制剂（RNAsin) 20U。首先70˚C预变性5min，然后加入逆转录酶MMLV 200U， 再于42˚C孵育1h，72˚C加热10min灭活逆转录酶。
1.3 Real-time PCR 反应：
1.3.1 方法学确认 根据引物相关信息PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并且对其纯化，假设纯化所得DNA浓度为a×10x，对其做10倍梯度稀释7次，稀释浓度依次为a×10x-1、a×10x-2、a×10x-3、a×10x-4、a×10x-5、a×10x-6、a×10x-7选择合适稀释品作为标准品模板。
1.3.2 取上述逆转录反应产物于20μl反应体系中进行PCR反应。PCR引物由上海之江生物科技有限公司合成。
表1 PCR中所用引物序列
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Primer |
Sequence (5′to 3′) |
Length（bp） |
|
GAPDH Forward primer |
5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3' |
276 |
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GAPDH Reverse primer |
5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3' |
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EMMPRINForward primer |
5’- TGGCCTTCACGTTCCTGAGT -3’ |
215 |
|
EMMPRINReverse primer |
5’ - GTCATCTGCATCCACCGTGT-3’ |
反应体系组成如下：10×Buffer（2μl）、dNTP 10 mmol /L(0.4μl)、MgCl2 25mmol/L (1.6μl)、5U TaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板2μl、上、下游特异引物各0.25μl、去离子水16.2μl。
按下述热循环参数运行：GAPDH内参照基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火56×15s，延伸72×15S（采光） 共30个循环。EMMPRIN基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火58×15s，延伸72×12s （采光）共35个循环。以SLAN软件分析并计算目的基因EMMPRIN与GAPDH的Ct值。
2 实验结果
2.1内参照基因、目的基因琼脂糖凝胶电泳结果：随机选择3份标本PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在理论片段大小位置有单一条带且无杂带和引物二聚体。结果见图：
图1：GAPDH电泳图 图2：EMMPRIN电泳图
2.2 试剂扩增效率验证：经过对标准品定量，内参照基因GAPDH扩增检测Ct值与浓度对数值的相关系数为0.99996，目的基因EMMPRIN扩增检测Ct值与浓度对数值的相关系数为0.99969。内参照基因和目的基因皆有良好的扩增效率（相关系数>0.98）。可用ΔCt法行数据统计。结果见图：
图三：GAPDH定量标准曲线
图四：GAPDH定量标准曲线荧光曲线
图五：EMMPRIN定量标准曲线
图六：EMMPRIN定量标准曲线荧光曲线
2.3 EMMPRIN定量PCR结果
采用SPSS 12统计分析软件对3组的ΔCt值进行统计分析（P<0.05为统计学差异显著），第1组与第3组、第2组与第3组间差异显著，第1组与第2组间无显著差异。结果见下表：
Multiple Comparisons
Dependent Variable: ΔCt
LSD
|
(I) 组别 |
(J) 组别 |
Mean Difference (I-J) |
Std. Error |
Sig. |
95% Confidence Interval |
|
|
Lower Bound |
Upper Bound |
|||||
|
1 |
2 |
.0383 |
.49261 |
.939 |
-1.0116 |
1.0883 |
|
3 |
-1.4667(*) |
.49261 |
.009 |
-2.5166 |
-.4167 |
|
|
2 |
1 |
-.0383 |
.49261 |
.939 |
-1.0883 |
1.0116 |
|
3 |
-1.5050(*) |
.49261 |
.008 |
-2.5550 |
-.4550 |
|
|
3 |
1 |
1.4667(*) |
.49261 |
.009 |
.4167 |
2.5166 |
|
2 |
1.5050(*) |
.49261 |
.008 |
.4550 |
2.5550 |
|
注：带 *表示两组间存在显著差异，第1组即 Ti-6Al-4V组，第2组即UHMWPE组，第3组即对照组
2.4 △△Ct法分析EMMPRIN定量结果
采用比较Ct法（△△Ct法）进行囊腔组织EMMPRIN的mRNA定量分析。其计算公式如下：
（1）Target A/Target B=2-(Ct1-Ct2)=2-△Ct；
（2）平均相对含量=2-平均△△Ct。
检测结果，实验组EMMPRIN的mRNA含量均明显高于对照组,是对照组的4倍。
表4 比较Ct法(△△Ct法)检测囊腔组织EMMPRIN的mRNA表达
(n =10)
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组别 |
平均Ct |
GAPDH之Ct |